Die Unterscheidung von Männchen und Weibchen geht bei Jungtieren von Landschildkröten noch nicht. Denn bei Landschildkröten gibt es nur sekundäre Geschlechtsmerkmale, die sich erst entwickeln wenn die Schildkröten etwas älter sind. So auffällige Merkmale wie sichtbare Hoden gibt es nicht, die befinden sich im Panzer.
Zur Geschlechtsbestimmung sollten Griechische Landschildkröten (Testudo hermanni), Maurische Landschildkröten (Testudo graeca ibera) und Vierzehenschildkröten (Testudo horsfieldii) eine Panzerlänge von mindestens 10 cm haben, das ist bei der Haltung im Freilandterrarium meistens nach drei bis fünf Jahren der Fall. Bei Breitrandschildkröten (Testudo marginata) ist es etwas schwieriger das Geschlecht zu erkennen, daher sollten diese Schildkröten dafür älter sein, ich empfehle sieben bis zehn Jahre.
Wenn du die Geschlechtsbestimmung mit einem der Merkmale aus der folgenden Tabelle vornimmst, rate ich dir dazu, dass du dich nicht auf ein Merkmal verlässt, sondern immer mehrere Merkmale zur Unterscheidung der Geschlechter von Landschildkröten berücksichtigst, so klappt es sicher.
| Männchen | Weibchen | |
| Schwanz | lang, Schwanzwurzel dicker, Kloake weiter vom Schwanzansatz entfernt | kurz, Schwanzwurzel dünner, Kloake näher am Schwanzansatz |
| Größe | kleiner und leichter | größer und schwerer |
| Afterschild | breit & kurz, Winkel flach | genauso lang wie breit, Winkel spitzer |
| Bauchpanzer | eingedellt (konkav) | flach |
Das Hauptmerkmal zur Unterscheidung der Geschlechter ist ihr Schwanz. Bei Männchen ist es länger und am Schwanzansatz dicker. Der Schwanz ist also insgesamt größer, das liegt daran, dass der Penis dort hineinpassen muss. Außerdem ist die Kloake (das ist der gemeinsame Ausgang der Reptilien für Kot, Urin und Geschlechtsorgane) weiter vom Schwanzansatz entfernt. Männliche Landschildkröten tragen ihren Schwanz bei der Fortbewegung meistens an den Körper angelegt. Laufen Weibchen durch die Gegend, so tragen sie den Schwanz oft ausgestreckt. Weibliche Landschildkröten haben einen eher kurzen und dünneren Schwanz, die Kloake ist näher am Schwanzansatz.
Die Griechische Landschildkröte hat als einzige Europäische Landschildkröte einen Hornnagel am Schwanzende. Dieser Hornnagel ist bei Männchen groß und kräftig. Bei weiblichen Testudo hermanni ist er hingegen nur andeutungsweise vorhanden.
In der Regel werden weibliche Landschildkröten größer und schwerer als männliche Landschildkröten. Bei Griechischen und Maurischen Landschildkröten ist es zum Beispiel auch so. Anders herum ist es hingegen bei der Breitrandschildkröte, dort werden die Männchen größer als die Weibchen.
Ein weiteres Merkmal bei Breitrandschildkröten (Testudo marginata) ist zu sehen wenn man von oben auf die Schildkröten guckt. Die Weibchen haben einen tonnenförmigen Panzer. Bei männlichen Breitrandschildkröten ist der Panzer in der Draufsicht hingegen tailliert, außerdem ist der namensgebende breite Rand am hinteren Teil des Panzers ausgeprägter.